內毒素，又稱脂多糖（LPS），是革蘭氏陰性細菌的主要細胞壁成份。內毒素的來源包括培養基、血清、水、緩沖溶液和其他細胞培養試劑，如胰蛋白酶。內毒素是體內外炎癥反應的有效誘導劑。內毒素污染是細胞培養和生產注射藥物中的主要問題。溶液和試劑可能是無菌但仍含有細菌成分，因此監測細胞培養試劑中是否存在內毒素至關重要。

內毒素的特點：

? 3 - 40 kDa：取決于O抗原的大小

? 兩親性：>1000 kDa 會在水溶液中形成聚集物

? 抗紫外線和熱穩定性 （最高180°C）

? 多糖：大小因細菌種類而異。在人體誘導特異性抗原反應。

? 脂質A：具有LPS毒性。刺激哺乳動物免疫系統。

內毒素的污染源：

1.水

使用高純度水制備培養基和溶液，清潔玻璃器皿。

2.玻璃器皿

為了消除內毒素，必須將玻璃器皿加熱至250°C（≥30分鐘），或加熱到180°C（3 小時）。

3.培養液、血清和添加劑

使用前要求制造商提供內毒素水平認證或測試。

4.塑料容器

要求制造商提供內毒素水平和無致熱源的證明。

體外和體內實驗的風險

內毒素在體外和體內實驗均可引起不穩定性。脂質A能夠激活細胞表面或內體的Toll樣受體4（TLR4），誘導MAP激酶（MAPK）及IRF（干擾素調節因子）通路的激活20, 21。盡管內毒素的作用隨濃度和細胞類型的不同而改變，但它們確實可以改變細胞形態、影響增殖和轉染效率22。此外，LPS還誘導了炎性細胞因子如TNF-α 、IL-1β 、IL-6 、IL-8 和 IL-18的產生，并激活 caspase 4/5/11-NLRP3 非經典炎癥小體，最后導致細胞焦亡20, 23。在體內實驗，低內毒素濃度可刺激免疫系統，而高濃度可引起發燒、低血壓、多器官衰竭，甚至死亡22。

使用生物試劑檢測內毒素

細胞比色分析法

HEK-Blue? LPS Detection Kit 2

??用途廣泛：適用于幾乎所有的生物試劑

??高靈敏度：檢測限為 0.01 EU/ml

? 經濟實惠：1個試劑盒最多可進行500次測試

試劑盒依賴于InvivoGen專有的HEK-Blue?-4細胞，該細胞穩定表達人源TLR4和一個NF-κB誘導的分泌型胚胎堿性磷酸酶（SEAP）報告基因。簡單的實驗程序使該試劑盒成為常規測試的理想選擇。只要樣品中含有微量的LPS，在與HEK-Blue?-4細胞孵育過夜后，會導致NF-κB的激活和SEAP報告基因的表達。培養上清液中的SEAP活性通過加上底物QUANTI-Blue?溶液，并使用分光光度計在620-655nm的波長測量。吸光度與內毒素含量成正比。使用試劑盒中提供的HEK-Blue?內毒素標準品，經系列稀釋獲得標準曲線從而計算內毒素濃度（大腸桿菌055:B5 LPS 的制備參照FDA批準的內毒素工作標準品（CSE）制備標準）。HEK-Blue? LPS檢測試劑盒2也是InvivoGen內部的常規內毒素檢測方法。

LPS檢測試劑盒2的原理（見下圖）

使用此試劑盒的5大原因

1.替代昂貴而耗時的鱟試劑（LAL）。購買此套件一次，凍存HEK-Blue?-4細胞，以后只需重新訂購其他耗材。

2.與LAL分析不同，如果樣品含有（1,3）-β-D-葡聚糖，使用HEK-Blue?-4細胞進行LPS檢測不會導致假陽性。

3.適用于所有生物樣品，包括培養基、血清、化學制劑和疫苗佐劑。

4.溶液顏色從粉紅色變為紫/藍色表示陽性反應，結果簡單可視。

5.包括一本實驗程序小冊子，計算內毒素濃度的方法，以及疑難排解部分

相關文獻：

— Gray M. A. et al., 2020. Nat Chem Biol. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. DOI: 10.1038/s41589-020-0622-x.

— Imbert P. R. C. et al., 2021. Curr Biol. An Acquired and Endogenous 

Glycocalyx Forms a Bidirectional “Don’t Eat” and “Don’t Eat Me” Barrier to Phagocytosis. DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.082.

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